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双荧光素酶报告基因检测


 

荧光素酶报告实验由于其快捷、廉价、灵敏度高和可定量等优点，已普遍用于细胞生物学的研究，如基因表达转录水平的研究。荧光素酶报告系统属于生物发光系统，其中的荧光素酶来自于不同生物体内的氧化酶，很多物种（细菌、海洋动物、昆虫等）中都含有荧光素酶，其中应用比较广泛的是荧火虫荧光素酶。它可以在一定条件下与底物发生化学反应产生可检测到的光，产生光的过程中几乎不产生热量，也就是说这个过程中几乎所有的能量全部转化为光能，这使得检测的灵敏度非常高。下面以报告基因实验（启动子）为例，来介绍双荧光素酶报告系统。
 

 荧光素酶反应原理

 
报告基因实验常用于研究目的基因的调控元件（启动子、增强子等），调控元件的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。整个报告基因的核心是将待定的调控元件与报告基因进行融合，检测报告基因的表达。由于报告基因的表达完全取决待定的调控元件，故报告基因的表达量与待定调控元件的活性直接相关。一个好的报告基因必须满足以下条件：
（1）在所检测的细胞内不存在；
（2）检测起来非常方便；
（3）灵敏度要高，最好可以定量。相比于传统的β-半乳糖苷酶（LacZ，真核生物内有内源性干扰）、氯霉素乙酰转移酶（CAT，检测复杂）、荧光蛋白（GFP、YFP、RFP等，灵敏度不高，有些细胞有自发荧光现象），荧光素酶检测系统具有明显的优势。
 

 
荧光素酶报告实验图解

 
由于荧光素酶超级灵敏的能力和宽广的动力学范围，荧光素酶系统得到了广泛的使用。通常荧光素酶的实验会将待检测的调控元件（启动子）安排在荧光素酶基因的上游，构建成载体，然后将构建完成的载体导入到合适的动物细胞中，通过检测荧光素酶的活性来判断调控元件的活性。
在荧光素酶报告系统中，只使用一种荧光素酶（一般为荧火虫荧光素酶），为单荧光素酶报告实验；由于不同的荧光素酶所发出的光具有不同的光谱性质，或使用不同的底物，一个报告实验中也可以使用两种或多种荧光素酶，其中最常用到的就是双荧光素酶（一般为荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶）报告实验，其中一种荧光素酶作为报告基因，另一种则作为内参，主要作用是减少外界因素对于实验数据产生的影响，这些影响主要包括操作误差、细胞接种差异、细胞处理的误差、孔间增殖差异等因素。因此，在调控元件（启动子、增强子）的研究中，双荧光素酶报告实验应用的会更多一些，整个的实验过程也非常的简便，如下图所示。
 

 
  荧光素酶报告实验流程

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